叶酸片的药代动力学过程主要包括吸收、分布、代谢和排泄四个环节。口服叶酸片后主要在十二指肠和空肠近端吸收，经门静脉进入肝脏，部分通过胆汁排泄形成肠肝循环，最终以原型或代谢物形式经肾脏排出。
叶酸片口服后在胃酸环境中解离为单谷氨酸叶酸，主要在小肠上段通过主动转运和被动扩散两种方式吸收。食物中的多谷氨酸叶酸需经肠道黏膜细胞内的γ-谷氨酰水解酶转化为单谷氨酸形式才能被吸收。吸收率受胃酸pH值、肠道功能及合并用药影响，空腹服用时生物利用度约为50-80%。
吸收后的叶酸通过门静脉进入肝脏，约50%在肝脏被摄取并转化为活性形式5-甲基四氢叶酸。未结合的叶酸广泛分布于全身组织，可透过胎盘屏障和血脑屏障，在红细胞和脑脊液中的浓度约为血浆浓度的2-3倍。体内储存量约为5-20mg，主要存在于肝脏。
叶酸在肝脏和肠黏膜细胞内经二氢叶酸还原酶催化，先后转化为二氢叶酸和四氢叶酸。四氢叶酸在维生素B12依赖性酶作用下进一步甲基化形成5-甲基四氢叶酸，这是血液循环中的主要活性形式。代谢过程需要维生素B2、B6、B12及锌离子等辅助因子参与。
约90%的叶酸以原型经肾小球滤过排出，其中大部分在近端肾小管被重吸收。胆汁排泄约占剂量的10%，形成肠肝循环。当血浆浓度超过肾小管重吸收阈值时，尿中排出量显著增加。肾功能不全者可能发生蓄积现象。
抗癫痫药和口服避孕药可能降低叶酸吸收，酒精会抑制叶酸代谢。遗传性亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变者代谢效率下降。胃大部切除术后患者吸收减少，需要增加剂量。妊娠期肾血流量增加会加速叶酸排泄。
服用叶酸片期间应保持均衡饮食，适量摄入富含天然叶酸的动物肝脏、深绿色蔬菜和豆类。避免与抑制叶酸吸收的药物同服，长期用药者需定期监测血清叶酸和维生素B12水平。特殊人群如孕妇、哺乳期妇女及慢性肾病患者应在医生指导下调整用药方案。
